VEGF p53和p21ras在原发性肝细胞癌中的表达及其临床病理意义
作者：纪子钊 王宝胜 张铭链 余云 王之章 刘峰
单位：中国医科大学第二临床学院普外科 (沈阳 110003) 纪子钊 王宝胜 张铭链 余云 王之章；鞍山钢铁公司铁东医院普外科 刘峰
关键词：原发性肝细胞癌；血管内皮生长因子；p53基因；ras基因；免疫组织化学
中国现代医学杂志990403 目的：研究VEGF，p53和p21ras在原发性肝细胞癌(HCC)的表达和三者间的相关性及其与HCC病理分级，转移行为的关系。方法：应用免疫组织化学S-P法对34例HCC的癌组织中的VEGF，p21ras和p53的表达作了研究。结果：VEGF，p21ras和p53三者在肝癌和癌旁组织的阳性率均有非常显著的差异(P<0.01)，VEGF的表达与p21ras和p53均呈显著的正相关(P<0.01)。三者间的协同表达亦与HCC的病理分级和转移行为有关，而与肿瘤大小，AFP水平，HBsAg阳性无关。结论：VEGF可能在HCC的形成，发展和转移中与p53和ras基因协同作用，三者的协同作用可能与HCC的病理分级和转移行为有关。
, 百拇医药
分类号 R735.7
原发性肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，估计每年新发病在10万以上，死亡率高，生存期短，其发病机理并不完全清楚。因此，从分子水平进一步阐明HCC的发生机理对其防治具有一定的意义。一些癌基因，抑癌基因及某些蛋白可能参与了HCC的形成、发展，并有可能在肿瘤形成、发展、转移的各阶段协同作用[1～3]。本研究应用免疫组织化学S-P法染色检测HCC及癌旁组织中VEGF，p21ras和p53的表达，以探讨三者之间的关系及临床病理意义，并初步探讨HCC的发病机理。
1 材料与方法
1.1 标本
收集中国医科大学第二临床学院1990～1996年手术切除的HCC标本34例，其中31例带有癌旁组织(PT)，病理诊断明确。其中男29例，女5例，年龄12～76岁，平均54.5岁。高分化9例，中分化19例，低分化6例。4例有门静脉分支内癌栓，6例有肝门淋巴结转移，1例有肩胛骨远隔转移。标本经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，厚约5μm，分别做HE与免疫组化染色。
, 百拇医药
1.2 主要试剂
兔抗人p53,p21ras单克隆抗体和兔抗人VEGF多克隆抗体，工作浓度为1∶50，1∶50，1∶20。SP试剂盒为即用型。
1.3 方法
免疫组织学链菌素亲生物素-过氧化物酶法(S-P法)。操作步骤按常规进行。用PBS液代替第一抗体作阴性对照。
1.4 结果判定
VEGF和p21ras为细胞浆和细胞膜着色，清晰红色为阳性判断标准。p53以细胞核着色为主，棕红色或棕褐色。染色范围以光镜下记数为准：(-)：无阳性染色细胞，(+)：阳性细胞数<25%，(++)：阳性细胞数26%～50%，(+++)：阳性细胞数>50%。将-，+，++，+++分别记分为0，1，2，3。
, 百拇医药 1.5 数据处理
采用χ2检验，相关性分析和多因素分析。
2 结果
2.1 VEGF，p52，p21ras的细胞表型和分布
VEGF染色位于胞浆内，癌组织中阳性细胞以弥漫分布为主，癌旁组织中以灶状分布为主；p53蛋白位于胞核内，癌组织多为弥漫分布，在癌旁组织呈散在分布；p21ras蛋白位于胞浆内，癌组织中阳性细胞以弥漫，灶状分布为主，癌旁组织中以灶状分布为主。
2.2 VEGF，p53,p21ras在癌组织和癌旁组织中的表达
VEGF，p21ras和p53在肝癌组织中的检出率分别为85.3%(+9/++16/+++4)，70.6%(8/11/5)，58.8%(4/14/2)。在癌旁组织间中的检出率分别为45.1%(7/3/4)，34.2%(3/5/2)，22.6%(3/4/0)。三者在肝癌和癌旁组织的阳性率均有非常的显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 HCC中VEGF，p53,p21ras表达的相关性
VEGF与p53，VEGF与p21ras表达呈非常显著的正相关，P<0.01。经多因素分析，VEGF，p53，p21ras之间亦有非常显著相关性，P<0.01。
2.4 VEGF，p53和p21ras的表达与HCC临床病理特征的关系
表1 VEGF，p53和p21ras的表达与HCC临床病理特征的关系 临床病理特征
例数
VEGF
VEGF-P53
VEGF-p21ras
VEGF-P53-p21ras
, http://www.100md.com
(+)
%
(+)
%
(+)
%
(+)
%
分化：高分化
9
5
55.61)
2
, http://www.100md.com
22.21)
3
33.31)
0
0.02)
中分化
19
18
94.7
10
52.6
14
, 百拇医药 73.7
8
42.1
低分化
6
6
100.00
5
83.8
5
83.8
4
66.7
肿瘤大小：≤5cm
, 百拇医药
16
13
81.3
7
43.8
10
62.5
3
18.7
≥5cm
18
16
88.9
, http://www.100md.com 10
55.6
12
66.7
9
50.0
AFP <400
23
20
87.0
11
47.8
14
, http://www.100md.com 60.8
8
34.8
(ng/ml) ≥400
11
9
81.8
6
54.5
8
72.7
4
36.4
, http://www.100md.com
HBsAg +
21
18
85.7
10
47.6
14
66.7
7
33.3
-
13
11
, 百拇医药
84.6
7
53.8
8
61.5
5
38.5
转移倾向： +
11
11
100.0
9
81.81)
, 百拇医药
8
72.7
8
72.72)
-
23
18
78.3
8
34.8
12
52.3
4
, 百拇医药
17.4
注：(+)是指两者或三者共同阳性表达例数。转移倾向本组中是指发现门静脉内癌栓，肝门淋巴结转移和远隔转移者。
1) P<0.05
2) P<0.11
3 讨论
3.1 VEGF，p53和p21ras在HCC中的表达
近年研究认为肿瘤不仅通过肿瘤血管从宿主获得丰富的营养，而且还要通过血管向宿主输出大量恶性细胞，导致肿瘤不断生长和转移。肿瘤的血管生成过程极为复杂，其中血管内皮生长因子对血管生成的调控作用较强，且特异性高[4，5]。在肿瘤血管生成，肿瘤生长和转移中起到重要作用。本研究结果表明，VEGF在HCC中有明显的高表达，且明显高于癌旁组织(P<0.01)，提示VEGF的过度表达与HCC的生成，发展可能有关，这与文献报道一致。研究表明，癌基因的激活和抑癌基因的失活及其编码产物的过度表达导致肿瘤细胞的恶性转化和增殖失调。本组病例中突变型p53，p21ras在HCC中亦有较高水平的表达，且明显高于癌旁组织(P<0.01)，说明HCC的形成，发展可能与ras基因的激活和p53基因的失活有关。
, 百拇医药
3.2 VEGF，p53,p21ras在HCC中的相关性分析
在恶性肿瘤发生的癌基因研究中，不少学者提出了多基因协同作用假说，认为在肿瘤发生，发展和转移的各阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的癌基因各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变。我们的研究结果提示，34例HCC中，p53和p21ras同时过度表达者占35.3%(12/34)，呈显著正相关(P<0.05)。与文献报道一致，从而从一方面支持了多基因协同作用假说。
近来有研究表明，突变的ras癌基因可以上调VEGF的表达，ras表达蛋白抑制物明显降低了VEGF的活性[6]，突变的p53基因增强了蛋白激酶C对VEGF表达的诱导[7]。本组34例HCC中，VEGF表达与p53和p21ras均呈非常显著的正相关(P<0.01)，三者同时过度表达者占35.3%(12/34)，经多因素分析，三者之间的相关性亦有非常显著的意义(P<0.01)。从而说明VEGF的表达可能受p53和p21ras调控。
, http://www.100md.com
3.3 VEGF，p53,p21ras的表达与HCC临床病理特征的关系
文献报道，VEGF，p53和p21ras的过度表达与许多肿瘤的恶性程度相伴。但三个指标中两者或三者协同表达与肿瘤恶性程度的关系报道较少。本组研究中，VEGF，p53和p21ras协同表达与HCC的病理分级有显著的相关性，其中三者同时表达者相关性非常显著(P<0.01)，提示VEGF，p53，p21ras协同表达与HCC的病理分级有显著的相关性，其中三者同时表达者相关性非常显著(P<0.01)，提示VEGF，p53，p21ras的协同作用影响和调控着HCC的分化，三者中协同表达越充分，HCC的分化程度越低，恶性程度越高。
研究表明VEGF是肿瘤新生血管生成的一个重要调控因素，肿瘤血管一方面为肿瘤细胞生长提供营养物质，另一方面为其转移提供条件。因此，VEGF的过度表达与肿瘤的侵袭和转移有密切关系。p53和ras基因已被认为是判断肿瘤转移和预后的重要指标。在本组研究中，由于缺乏随访资料，而且有些病例类型例数少，因此不能全面地对此作出评估。我们统计了临床资料中提示有转移倾向者(或有远处转移)作为一组，余为对照组，进行比较，发现VEGF与p53协同表达阳性率在二组间有显著性差异(P<0.05)，三者协同表达阳性率则有非常显著的差异(P<0.01)，从而在某种程度上也提示在HCC中VEGF，p53，p21ras有可能协同作用促使肿瘤侵袭和转移。进而，我们可以对肝癌的基因谱概念进一步的延伸：那就是肝癌的形成，发展不仅是多种癌基因共同作用的结果，而且是多种基因和蛋白共同协同作用的结果。我们可以作出如下假设：p53，ras等基因激发了HCC的发生，并且可能调节或增强了VEGF的表达，而VEGF的高表达反过来又促进了HCC的过度增殖和转移，从而增强了突变型p53，ras等基因的致癌效应，它们的协同作用在HCC形成，发展和转移中发挥重大作用。
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4 结论
HCC中VEGF表达与p53,p21ras基因有显著的相关性，可能受其调控。VEGF，p53，ras三者协同表达与HCC的恶性程度，侵袭和转移能力有关。
参考文献
1 Hunter T.Cooperation between Oncogenes.Cell,1991;64:249
2 顾健人，陈渊清，蒋惠秋，等.人原发性肝癌的癌基因谱.肿瘤，1988；8：289
3 李 华.多基因变异与肝细胞癌.实用肿瘤学杂志，1998；12(1)：76～78
4 Folkman T,Shing Y.Angiogenesis.J Biol Chem,1991;267:10931-10934
, 百拇医药
5 Dvorak HF,Brown LF,Detmar M,et al.Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor,Microvascular Hyperpermaebility and Angiogenesis.Am J Path,1995;146:1029～1039
6 Rak J,Mitsuhashi Y,Bayko L,et al.Mutant ras oncogenes upregulate VEGF/VPF expression implications for induction and inhibition of tumor Angiogenesis.Cancer Res,1995;55:4575～4580
7 Kieser A,Weich HA,Brander G,et al.Mutant p53 potentiates protein kinase C induction of vascular endothelial growth factor expression.Oncogene,1994;9:964～969
1998-11-21收稿, 百拇医药
单位：中国医科大学第二临床学院普外科 (沈阳 110003) 纪子钊 王宝胜 张铭链 余云 王之章；鞍山钢铁公司铁东医院普外科 刘峰
关键词：原发性肝细胞癌；血管内皮生长因子；p53基因；ras基因；免疫组织化学
中国现代医学杂志990403 目的：研究VEGF，p53和p21ras在原发性肝细胞癌(HCC)的表达和三者间的相关性及其与HCC病理分级，转移行为的关系。方法：应用免疫组织化学S-P法对34例HCC的癌组织中的VEGF，p21ras和p53的表达作了研究。结果：VEGF，p21ras和p53三者在肝癌和癌旁组织的阳性率均有非常显著的差异(P<0.01)，VEGF的表达与p21ras和p53均呈显著的正相关(P<0.01)。三者间的协同表达亦与HCC的病理分级和转移行为有关，而与肿瘤大小，AFP水平，HBsAg阳性无关。结论：VEGF可能在HCC的形成，发展和转移中与p53和ras基因协同作用，三者的协同作用可能与HCC的病理分级和转移行为有关。
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分类号 R735.7
原发性肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，估计每年新发病在10万以上，死亡率高，生存期短，其发病机理并不完全清楚。因此，从分子水平进一步阐明HCC的发生机理对其防治具有一定的意义。一些癌基因，抑癌基因及某些蛋白可能参与了HCC的形成、发展，并有可能在肿瘤形成、发展、转移的各阶段协同作用[1～3]。本研究应用免疫组织化学S-P法染色检测HCC及癌旁组织中VEGF，p21ras和p53的表达，以探讨三者之间的关系及临床病理意义，并初步探讨HCC的发病机理。
1 材料与方法
1.1 标本
收集中国医科大学第二临床学院1990～1996年手术切除的HCC标本34例，其中31例带有癌旁组织(PT)，病理诊断明确。其中男29例，女5例，年龄12～76岁，平均54.5岁。高分化9例，中分化19例，低分化6例。4例有门静脉分支内癌栓，6例有肝门淋巴结转移，1例有肩胛骨远隔转移。标本经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，厚约5μm，分别做HE与免疫组化染色。
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1.2 主要试剂
兔抗人p53,p21ras单克隆抗体和兔抗人VEGF多克隆抗体，工作浓度为1∶50，1∶50，1∶20。SP试剂盒为即用型。
1.3 方法
免疫组织学链菌素亲生物素-过氧化物酶法(S-P法)。操作步骤按常规进行。用PBS液代替第一抗体作阴性对照。
1.4 结果判定
VEGF和p21ras为细胞浆和细胞膜着色，清晰红色为阳性判断标准。p53以细胞核着色为主，棕红色或棕褐色。染色范围以光镜下记数为准：(-)：无阳性染色细胞，(+)：阳性细胞数<25%，(++)：阳性细胞数26%～50%，(+++)：阳性细胞数>50%。将-，+，++，+++分别记分为0，1，2，3。
, 百拇医药 1.5 数据处理
采用χ2检验，相关性分析和多因素分析。
2 结果
2.1 VEGF，p52，p21ras的细胞表型和分布
VEGF染色位于胞浆内，癌组织中阳性细胞以弥漫分布为主，癌旁组织中以灶状分布为主；p53蛋白位于胞核内，癌组织多为弥漫分布，在癌旁组织呈散在分布；p21ras蛋白位于胞浆内，癌组织中阳性细胞以弥漫，灶状分布为主，癌旁组织中以灶状分布为主。
2.2 VEGF，p53,p21ras在癌组织和癌旁组织中的表达
VEGF，p21ras和p53在肝癌组织中的检出率分别为85.3%(+9/++16/+++4)，70.6%(8/11/5)，58.8%(4/14/2)。在癌旁组织间中的检出率分别为45.1%(7/3/4)，34.2%(3/5/2)，22.6%(3/4/0)。三者在肝癌和癌旁组织的阳性率均有非常的显著性差异(P<0.01)。
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2.3 HCC中VEGF，p53,p21ras表达的相关性
VEGF与p53，VEGF与p21ras表达呈非常显著的正相关，P<0.01。经多因素分析，VEGF，p53，p21ras之间亦有非常显著相关性，P<0.01。
2.4 VEGF，p53和p21ras的表达与HCC临床病理特征的关系
表1 VEGF，p53和p21ras的表达与HCC临床病理特征的关系 临床病理特征
例数
VEGF
VEGF-P53
VEGF-p21ras
VEGF-P53-p21ras
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中分化
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52.6
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8
42.1
低分化
6
6
100.00
5
83.8
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83.8
4
66.7
肿瘤大小：≤5cm
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11
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23
18
78.3
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17.4
注：(+)是指两者或三者共同阳性表达例数。转移倾向本组中是指发现门静脉内癌栓，肝门淋巴结转移和远隔转移者。
1) P<0.05
2) P<0.11
3 讨论
3.1 VEGF，p53和p21ras在HCC中的表达
近年研究认为肿瘤不仅通过肿瘤血管从宿主获得丰富的营养，而且还要通过血管向宿主输出大量恶性细胞，导致肿瘤不断生长和转移。肿瘤的血管生成过程极为复杂，其中血管内皮生长因子对血管生成的调控作用较强，且特异性高[4，5]。在肿瘤血管生成，肿瘤生长和转移中起到重要作用。本研究结果表明，VEGF在HCC中有明显的高表达，且明显高于癌旁组织(P<0.01)，提示VEGF的过度表达与HCC的生成，发展可能有关，这与文献报道一致。研究表明，癌基因的激活和抑癌基因的失活及其编码产物的过度表达导致肿瘤细胞的恶性转化和增殖失调。本组病例中突变型p53，p21ras在HCC中亦有较高水平的表达，且明显高于癌旁组织(P<0.01)，说明HCC的形成，发展可能与ras基因的激活和p53基因的失活有关。
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3.2 VEGF，p53,p21ras在HCC中的相关性分析
在恶性肿瘤发生的癌基因研究中，不少学者提出了多基因协同作用假说，认为在肿瘤发生，发展和转移的各阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的癌基因各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变。我们的研究结果提示，34例HCC中，p53和p21ras同时过度表达者占35.3%(12/34)，呈显著正相关(P<0.05)。与文献报道一致，从而从一方面支持了多基因协同作用假说。
近来有研究表明，突变的ras癌基因可以上调VEGF的表达，ras表达蛋白抑制物明显降低了VEGF的活性[6]，突变的p53基因增强了蛋白激酶C对VEGF表达的诱导[7]。本组34例HCC中，VEGF表达与p53和p21ras均呈非常显著的正相关(P<0.01)，三者同时过度表达者占35.3%(12/34)，经多因素分析，三者之间的相关性亦有非常显著的意义(P<0.01)。从而说明VEGF的表达可能受p53和p21ras调控。
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3.3 VEGF，p53,p21ras的表达与HCC临床病理特征的关系
文献报道，VEGF，p53和p21ras的过度表达与许多肿瘤的恶性程度相伴。但三个指标中两者或三者协同表达与肿瘤恶性程度的关系报道较少。本组研究中，VEGF，p53和p21ras协同表达与HCC的病理分级有显著的相关性，其中三者同时表达者相关性非常显著(P<0.01)，提示VEGF，p53，p21ras协同表达与HCC的病理分级有显著的相关性，其中三者同时表达者相关性非常显著(P<0.01)，提示VEGF，p53，p21ras的协同作用影响和调控着HCC的分化，三者中协同表达越充分，HCC的分化程度越低，恶性程度越高。
研究表明VEGF是肿瘤新生血管生成的一个重要调控因素，肿瘤血管一方面为肿瘤细胞生长提供营养物质，另一方面为其转移提供条件。因此，VEGF的过度表达与肿瘤的侵袭和转移有密切关系。p53和ras基因已被认为是判断肿瘤转移和预后的重要指标。在本组研究中，由于缺乏随访资料，而且有些病例类型例数少，因此不能全面地对此作出评估。我们统计了临床资料中提示有转移倾向者(或有远处转移)作为一组，余为对照组，进行比较，发现VEGF与p53协同表达阳性率在二组间有显著性差异(P<0.05)，三者协同表达阳性率则有非常显著的差异(P<0.01)，从而在某种程度上也提示在HCC中VEGF，p53，p21ras有可能协同作用促使肿瘤侵袭和转移。进而，我们可以对肝癌的基因谱概念进一步的延伸：那就是肝癌的形成，发展不仅是多种癌基因共同作用的结果，而且是多种基因和蛋白共同协同作用的结果。我们可以作出如下假设：p53，ras等基因激发了HCC的发生，并且可能调节或增强了VEGF的表达，而VEGF的高表达反过来又促进了HCC的过度增殖和转移，从而增强了突变型p53，ras等基因的致癌效应，它们的协同作用在HCC形成，发展和转移中发挥重大作用。
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4 结论
HCC中VEGF表达与p53,p21ras基因有显著的相关性，可能受其调控。VEGF，p53，ras三者协同表达与HCC的恶性程度，侵袭和转移能力有关。
参考文献
1 Hunter T.Cooperation between Oncogenes.Cell,1991;64:249
2 顾健人，陈渊清，蒋惠秋，等.人原发性肝癌的癌基因谱.肿瘤，1988；8：289
3 李 华.多基因变异与肝细胞癌.实用肿瘤学杂志，1998；12(1)：76～78
4 Folkman T,Shing Y.Angiogenesis.J Biol Chem,1991;267:10931-10934
, 百拇医药
5 Dvorak HF,Brown LF,Detmar M,et al.Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor,Microvascular Hyperpermaebility and Angiogenesis.Am J Path,1995;146:1029～1039
6 Rak J,Mitsuhashi Y,Bayko L,et al.Mutant ras oncogenes upregulate VEGF/VPF expression implications for induction and inhibition of tumor Angiogenesis.Cancer Res,1995;55:4575～4580
7 Kieser A,Weich HA,Brander G,et al.Mutant p53 potentiates protein kinase C induction of vascular endothelial growth factor expression.Oncogene,1994;9:964～969
1998-11-21收稿, 百拇医药